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产品简介

小金棋牌游戏技术(single cell sequencing)是指在单个细胞水平上,对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析的一项新技术,它能够弥补传统高通量测序的局限性,揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态,反映细胞间的异质性。2013年,小金棋牌游戏技术被《Science》将其列为年度最值得关注的六大领域榜首;2015年再次登上Science转化医学封面。目前,小金棋牌游戏技术在肿瘤、发育生物学、微生物学、神经科学、以及植物学等领域发挥重要作用,正成为生命科学研究的焦点,具有广阔的应用前景。


单细胞转录组测序流程

(https://en.wikipedia.org/wiki/Single_cell_sequencing)

我们的优势

1. 拥有国际认可的10X Genomics和BD Phrapsody单细胞平台,实现真正意义上的小金棋牌游戏;

2. 具有丰富的、针对不同样本类型的单细胞悬液制备经验,如:外周血、细胞系、新鲜/冻存器官组织、肿瘤组织,确保细胞活性达到测序要求;

3. 拥有成熟的小金棋牌游戏文库构建技术,一次性完成1000-10000个细胞的文库构建,真正测全组织中所有细胞类型,做到对样本中所有类型细胞的全面解析;

4. 具备完善的小金棋牌游戏和实验质控流程,以及丰富的小金棋牌游戏和数据分析经验,实现个性化、定制化数据分析服务。



样本要求

样本类型:

组织、血液、培养的细胞系、制备好的单细胞悬液

注:若客户样本为组织,且无能力进行组织解离来获取单细胞悬液,烈冰将尽可能提供技术及实验上的帮助,但因不同类型样本的特异性,无法保证实验方法适用于所有类型组织。

质量要求:

1. 细胞活性大于70%

2. 浓度为500-2000细胞/μl

3. 体积不小于200μl

4. 细胞培养基及缓冲液不能含Ca2+和Mg2+

5. 细胞体积小于40μm



实验流程


1. 单细胞悬液制备:根据样本特性选择合适的单细胞悬液制备方法,注意红细胞裂解;如若客户样本为已经制备好单细胞悬液,该步骤可以省略;

2. 细胞活性检测:细胞活性需大于70%;

3. 单细胞捕获:通过分选平台(BD、10X、Drop-seq)对每个细胞进行捕获;

4. 细胞/转录本标签添加:对结合磁珠标签的RNA进行逆转录引入CB和UMI;

5. 文库构建:对cDNA进行随机引物PCR扩增;

6. 上机测序:烈冰推荐Illumina Hiseq或NovaSeq测序平台,数据量100G/样本。


数据分析流程


结果示例

1、单细胞悬液制备(附加收费项目)
根据研究目的和对象获取新鲜的样本,包括不同类型的肿瘤样本及其对应的正常样本。再根据组织样本的特性,选择合适的消化条件(酶液、消化温度和时间),过筛后获得所需单细胞悬液。

单细胞悬液的制备流程



2、单细胞计数和活性检测
将细胞从培养液体系更换为上样缓冲液体系(Sample Buffer),采用Countstar或BD Rhapsody Scanner能够准确判断细胞数量以及活性状态。(注意:当红细胞/死细胞比例过多时,建议去除此类细胞,保证有效数据量。)

BD Rhapsody Scanner检测图

注:活细胞检测明场图(左),绿色荧光(中),红色荧光(右)



3、单细胞捕获
采用10X Genomics或BD Rhapsody单细胞捕获平台,将每个细胞及其mRNA标记上对应的标签。将收集的带上磁珠标签的RNA进行反转录,产物可于4℃环境下带回公司进行后续操作。


图一:Drop-Seq

哈佛医学院Steven McCarroll领导的团队将微流控技术引入单细胞RNA-seq方法中,开发了Drop-seq技术,且该项技术于2015年发表于《Cell》杂志上(Macosko et al., 2015)。Drop-seq技术利用微流体装置将带有细胞条形码的微珠和细胞一起装入微滴。这些液滴在一个小型设备上生成,沿着一根头发宽的槽道流动。条形码附着到每个细胞的一些基因上,因此科学家们可以一次测序所有的基因,追踪每个基因的来源细胞。


图二:10X Genomics

2016年,10X Genomics公司首次推出ChromiumTM系统,全面对接Illumina测序仪,能够自动化完成大规模单细胞研究。10X Genomics单细胞捕获平台起源自Drop-Seq技术,通过“双十字”微流控系统形成一个个含有细胞和凝胶微珠(gel bead)的油包水的乳滴(GEMs),其核心技术在于凝胶微珠表面的引物序列,由标记细胞的Barcode、标记细胞内mRNAUMI和捕获mRNAPoly dT组成。10X Genomics ChromiumTM系统可实现数千乃至数万个单细胞的分析,解决常规scRNA-seq在通量或扩展性方面存在的不足。


图三:BD Rhapsody

BD Rhapsody?单细胞分析系统的诞生基于 BD 在细胞生物学领域 40年的专业技术, 采用CytoSeq特有的蜂窝板技术进行单细胞捕获。该技术用20W+的微孔(该数量级远大于Input细胞数量),保证单孔中的单细胞捕获。同时避免了传统微流控系统中存在的概率碰撞影响捕获效率的问题,采用微孔捕获相对会有更好的捕获效率,保证Input细胞的全面使用。






4、高通量测序
PCR扩增后开始进行文库构建,获得每个样本的测序文库。接着采用Illumina Hiseq或NovaSeq高通量测序仪对单细胞转录组文库进行测序,获得每个样本的测序数据。

NovaSeq 6000测序仪

5、细胞数量判断
采用Fastp软件对下机原始数据进行质控,对质控后测序数据中的cell barcode信息及其对应的counts数进行统计,判断测序样本中实际检测到的细胞数量,获得样本的测序细胞数,并根据最终确认的cell barcode信息提取对应的reads。

注:横坐标为细胞数量,纵坐标为每个细胞对应的平均counts数,根据曲线的斜率判断实际检测的细胞数量



6、基因组比对和表达量统计
以cell barcode对应的reads为研究对象,采用STAR算法将测序数据比对到物种对应的基因组上,获得基因组比对的bam文件。再以bam文件以及基因组注释文件为研究对象,将比对到同一基因上的UMI进行合并,并去除其中重复的UMI序列,得到每个基因的UMI数量,统计每个细胞中检测到的基因数以及转录本数量,并得到表达量矩阵表。

注:左图为细胞中总共检测到的基因数量,右图为去除重复UMI后统计的基因数量



7、细胞过滤和数据标化
利用基因组比对结果以及表达量结果对测序检测到的细胞进行过滤,去除细胞中基因检测数少、线粒体基因占比大的细胞,统计过滤后的细胞数量并得到对应的表达量矩阵表。采用数据标准化方法(CPM/RLE/UQ/TMM/scran/Downsampling等),对不同样本中细胞基因表达量进行标准化,得到标准化后的表达量矩阵表。

注:横坐标表示每个细胞中UMI的数量,纵坐标表示线粒体基因的占比情况



8、细胞亚群分析
基于每个细胞中的基因表达量数据,采用聚类算法对细胞进行亚群分析,同时采用t-SNE分析对细胞的分群结果进行可视化展示。同时,还可以对不同样本中各细胞亚群的占比情况进行统计分析。

Azizi E et al., Cell. 2018

注:上图为乳腺癌肿瘤组织、正常组织、血液和淋巴结样本中免疫细胞亚群鉴定;下图为不同组织样本中各细胞亚群的占比情况



9、Marker基因鉴定
鉴定不同细胞亚群中的Marker基因,并对Marker基因的表达分布进行可视化展示。

Dick S A et al., Nature immunology. 2019

注: marker基因的Feature Plot图(上)和Violin图(下)



10、差异基因筛选
针对所有或者特定细胞亚群,进行细胞亚群间差异表达基因筛选,获得细胞亚群间差异表达基因。

Dick S A et al., Nature immunology. 2019

注:该图为不同细胞亚群间差异基因聚类分析图(Heatmap)



11、功能分析(GO Analysis)和信号通路分析(Pathway Analysis)
分别采用NCBI/UNIPROT/SWISSPROT/AMIGO等GO数据库,以及KEGG数据库,对Marker基因/差异基因进行功能分析和信号通路分析,从而得到这些基因群体所显著性富集的GO条目和Pathway条目。

Dick S A et al., Nature immunology. 2019

注:该图为不同cluster之间差异基因显著富集的Pathway条目



高级数据分析
1、RNA velocity分析
采用velocyto算法,预测单个细胞的变化方向,得到细胞间的转变过程。

Manno G L et al., Nature, 2018

注:该图为RNA velocity分析结果图,图中箭头方向代表算法预测的细胞演化方向



2、Pesudotime分析
以细胞的表达量数据为研究对象,采用TSCAN/monocle/SLICER/Ouija等算法,在虚拟时间轴上对细胞的变化模式进行分析,模拟重建细胞的动态变化过程,获得细胞间的状态转换关系,以及不同状态细胞间差异基因的表达情况。

Dick S A et al., Nature immunology. 2019

注:细胞间状态转换的pesudotime轨迹图(右)和Heatmap图(左)



3、细胞间通讯分析
以细胞亚群的基因表达量数据为研究对象,获得细胞中的配体及受体基因的表达信息,得到细胞亚群间的信号通讯关系。

Vento-Tormo R et al., Nature. 2018

注:横坐标表示细胞类型,纵坐标表示细胞间通讯关系,圆圈大小表示显著性差异水平,圆圈颜色越红表示细胞间通讯关系越强



4、TCGA预后联合分析
以TCGA临床信息以及筛选到的关键基因为研究对象,结合TCGA临床数据,进行预后分析,获得该基因/基因集与临床预后之间的关系。

Guo X, et al. Nature Medicine, 2018

注:横坐标表示生存期,纵坐标表示占比,不同颜色曲线代表不同分组



文献示例

[1] Mickelsen LE, Bolisetty M, Chimileski BR, et al. Single-cell transcriptomic analysis of the lateral hypothalamic area reveals molecularly distinct populations of inhibitory and excitatory neurons[J]. Nat Neurosci. 2019 Apr;22(4):642-656.(IF=19.912)


[2] Pijuan-Sala B, Griffiths JA, Guibentif C, et al. A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis[J]. Nature. 2019 Feb;566(7745):490-495.(IF=41.577)


[3] Cao J, Spielmann M, Qiu X, et al. The single-cell transcriptional landscape of mammalian organogenesis[J]. Nature. 2019 Feb;566(7745):496-502.(IF=41.577)


[4] Tiklová K, Bj?rklund ?K, Lahti L, et al. Single-cell RNA sequencing reveals midbrain dopamine neuron diversity emerging during mouse brain development[J]. Nat Commun. 2019 Feb 4;10(1):581.(IF=12.353)


[5] Bartoschek M, Oskolkov N, Bocci M, et al. Spatially and functionally distinct subclasses of breast cancer-associated fibroblasts revealed by single cell RNA sequencing[J]. Nat Commun. 2018 Dec 4;9(1):5150.(IF=12.353)


[6] Guo X, Zhang Y, Zheng L, et al. Global characterization of T cells in non-small-cell lung cancer by single-cell sequencing[J]. Nature Medicine. 2018 Jul;24(7):978-985.(IF=32.621)


[7] Azizi E, Carr AJ, Plitas G, et al. Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment[J]. Cell. 2018 Aug 23;174(5):1293-1308.e36.(IF=31.398)


[8] Fujii M, Matano M, Toshimitsu K,et al. Human Intestinal Organoids Maintain Self-Renewal Capacity and Cellular Diversity in Niche-Inspired Culture Condition[J]. Cell Stem Cell. 2018 Dec 6;23(6):787-793.e6.(IF=23.29)


[9] Dick SA, Macklin JA, Nejat S, et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction[J]. Nat Immunol. 2019 Jan;20(1):29-39.(IF=21.809)


[10] Kumar M P, Du J, Lagoudas G, et al. Analysis of Single-Cell RNA-Seq Identifies Cell-Cell Communication Associated with Tumor Characteristics[J]. Cell Reports. 2018 Nov 6;25(6):1458-1468.e4.(IF=8.032)