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产品简介

16S rDNA是原核生物中编码核糖体小亚基rRNA的DNA序列,承担着许多重要的生物学功能。其具有9个高变区域(V1-V9)和10个保守区域,保守区反映细菌种属间亲缘关系,而高变区则反映了物种间的特异性。因此通过分析16S rDNA 可变区的序列即可得到各细菌的分类学特征,结合高通量测序可研究环境或者临床样本中的微生物组成及群落功能。

Bacterial 16S rDNA sequencing workflow

Kong HH., Trends in Molecular Medicine. 2011

我们的优势


1. 更多的Reads数:所测Reads数达100000条,同成本下相较于Miseq,能检测更多的测序序列和稀有微生物;

2. 更高的数据质量:新一代HiQ,优于Q30级别的完美数据质量,具有更大的反应体系、更长的碱基读长以及高保真度的碱基识别能力;

3. 更高的检测灵敏度:均一的覆盖度,高检测灵敏度,以及更高的检测通量,相较于PGM,更多的微生物物种被准确鉴定;

4. 更广的覆盖范围:可覆盖更广的可变区,大幅提升后续对序列进行物种注释时的准确度和灵敏度。



样本要求

DNA样品

1. 浓度≥50ng/μL,体积≥60μL;

2. OD260/280介于1.8-2.0之间;

3. 电泳检测无明显RNA污染,基因组条带清晰、完整,无降解;

4. 送样时请标记清楚样品编号,管口使用Parafilm膜密封;

5. 样品保存期间切忌反复冻融;

6. 送样时请使用干冰运输。

环境样本(如土壤、植物根系、海水、肠道等)应详细描述样本特征,如土壤:硬度较大,接近石块、取自河边,松软等。

组织样品提取DNA要注明是内生菌还是外生菌。


实验流程



1. 客户样本:土壤、植物根系、海水、空气、粪便、唾液等;

2. DNA提取及质控:QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒;

3. 目标区域PCR:引物为16s-V3区、带有Barcode的特异性引物(338F-518R);

4. 文库构建:life公司的Ion Plus Fragment Library Kit建库试剂盒;

5. 上机测序:烈冰推荐life公司的Ion S5测序仪,数据量:30000 reads。



数据分析流程

结果示例

1、物种鉴定
获得每个OTU(operational taxonomic units)的核心序列之后,与silva 库(http://www.arb-silva.de/)中的 aligned(15S, SSU)核糖体序列进行数据库比对,得到每一个OTU的物种鉴定情况和丰度。

Krona样本物种丰度情况

Zamanzadeh M et al., Water Reseqrch. 2016

注:该图展示了两个样本(MD和MD+R)中每个分类群的丰度,每个分类群前的数字代表鉴定为该分类群的reads数占总reads数的百分比



2、微生物群落结构分析
将OTU序列同时与GreenGenes、Silva和RDP等多个数据库进行比对,并进行reads数目统计,分析不同样品中的微生物物种差异和丰度变化。

微生物群落结构分析

Garcia-Mena et al., Microb Ecol, 2016

注:该图展示了正常饮食(SCD)和高脂喂养(HFD)条件下食物过敏与否对消化道微生物群落结构的不同


3、稀释性曲线分析
从样本中随机抽取一定数量的 reads,统计这些 reads 所代表的物种数目。比较测序数据量不同的样本中物种的丰富度,也可以用来说明样本的测序数据量是否合理。

稀释性曲线分析结果

注:当曲线趋向平坦时,说明测序数据量合理,更多的数据量只会产生少量新的OTU,反之则表明继续测序还可能产生较多新的 OUT



4、Alpha多样性分析
Alpha多样性(样本内多样性)是指一个特定区域或者生态系统内的多样性,常用的度量指标有Chao1 丰富度估计量(Chao1 richness estimator)、香农-威纳多样性指数(Shannon-wiener diversity index)、辛普森多样性指数(Simpson diversity index)等。计算菌群丰度指标有Chao1和ace;计算菌群多样性的指标有Shannon和Simpson。

Alpha多样性

注:该图展示了不同样本的Chao1丰富度估计量


5、Beta多样性分析
Beta多样性(样品间差异分析)计算主要反映不同样本之间的差异度,度量时空尺度上物种组成的变化, 是生物多样性的重要组成部分, 与许多生态学和进化生物学问题密切相关。beta多样性计算根据是否考虑OTU的相对丰度,可分为定量指数和定性指数。凡是分析样品间差异多样性差异的均属于beta多样性分析。

Beta多样性分析结果

Micha? Kolasa et al., Microbial Ecology. 2019

注:该图展示了样本间的差异多样性



6、LefSe分析
首先在多组样本中采用的非参数因子Kruskal-Wallis秩和检验检测不同分组间丰度差异显著的物种(a);然后在上一步中获得的显著差异物种,用成组的Wilcoxon秩和检验来进行组间差异分析;最后用线性判别分析(LDA)对数据进行降维和评估差异显著的物种的影响力(即LDA score)。

LefSe分析

Lelouvier et al., Hepatology,2016

注:该图展示了两组粪便样本中差异的微生物群体


7、PICRUSt分析
采用STAMP软件,可以直接使用来自QIIME的biom文件和PICRUSt的KEGG和ko 文件分析提供精细的功能基因的数量和构成的预测,以及进行样本间以及组间的差异分析,并给出具有统计意义和置信区间的分析结果。这一分析将我们对于样本群落的差异进一步深入到了每一类基因的层面,相当于把微生物和功能结合。

PICRUSt分析结果

注:该图展示了组间的差异KO功能条目



8、物种共富集分析
共富集分析使用CCREPE算法,首先对原始16S rDNA测序数据的种属数量进行标准化,然后进行秩相关分析并进行统计检验,计算出各个物种之间的相关性,之后在所有物种中根据SimScore绝对值的大小,挑选出相关性最高的数据,基于Cytoscap绘制共表达分析网络图。

物种共富集分析

Odamaki et al., BMC Microbiology, 2016

注:该图展示了9个共富集群体的属间关系。不同颜色圆点表示一个共富集群体,圆点大小表示属的丰度



高级数据分析

文献示例

[1] Hussain M, Bonilla-Rosso G, Kwong Chung CKC, et al. High dietary fat intake induces a microbiota signature that promotes food allergy[J]. J Allergy Clin Immunol. 2019 Feb 13. pii: S0091-6749(19)30205-2.


[2] Kolasa M, ?cibior R, Mazur MA, et al. How Hosts Taxonomy, Trophy, and Endosymbionts Shape Microbiome Diversity in Beetles. Microb Ecol. 2019 Mar 27.


[3] Xia X, Zhang P, He L, et al., Effects of tillage managements and maize straw returning on soil microbiome using 16S rDNA sequencing[J]. J Integr Plant Biol. 2019 Mar 26.


[4] Hill C J, Lynch D B, Murphy K, et al. Evolution of gut microbiota composition from birth to 24 weeks in the INFANTMET Cohort[J]. Microbiome, 2017, 5(1):4.


[5] Zamanzadeh M, Hagen L H, Svensson K, et al. Anaerobic digestion of food waste–Effect of recirculation and temperature on performance and microbiology[J]. Water Research, 2016, 96.


[6] Odamaki T, Kato K, Sugahara H, et al. Age-related changes in gut microbiota composition from newborn to centenarian: a cross-sectional study[J]. BMC Microbiology, 2016, 16(1):90.


[7] García-Mena J, Murugesan S, Pérez-Mu?oz AA, et al. Airborne Bacterial Diversity from the Low Atmosphere of Greater Mexico City[J]. Microbial Ecology, 2016, 72(1):70-84.


[8] Lelouvier B, Servant F, Sandrine Pa?ssé, et al. Changes in blood microbiota profiles associated with liver fibrosis in obese patients: A pilot analysis[J]. Hepatology, 2016, 64(6):2015-2027.